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清华大学研究院博导白净卫:细数基因测序技术的历代创新,病原体研究或成为下一个应用热点

作者:王婵 2020-03-14 08:00

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对比2002年历经四个月才确定下来的SARS病毒,2019年新型冠状病毒的确认要迅速得多。从公开资料披露的首例肺炎患者出现,到其确诊,期间十天不到的时间便抓住了背后的罪魁祸首——新型冠状病毒(COVID-19)。能够如此高效地识别这种新型冠状病毒,离不开高通量基因测序技术的参与。

 

高通量基因测序是精准医疗的核心技术,动脉网(微信号:vcbeat)联合清华大学私募股权研究院共同举办了“疫情对医疗行业影响的系列活动”,邀请清华大学研究员、博士生导师白净卫就基因测序技术在此次疫情中的突出应用以及未来该领域值得关注的技术产品做了相关学术分享。

 

白净卫博士毕业于美国加州大学,后在IBM沃森实验室从事博士后研究,2013年至2016年期间受聘于美国基因测序技术公司Illumina从事研发工作。

 

动脉网对白净卫在此次VB群访谈中分享的精彩内容进行了整理,从基因测序技术的概况、发展、创新等多个维度进行了解读。

 

基因测序正处于从科研转向大规模临床应用的临界爆发阶段

 

基因是地球上的生命体最基本的遗传物质,基因测序是帮助我们解读这些遗传信息的重要工具。从科学的角度来讲,基因测序是我们认识生命、进行科学研究最基本的工具之一。

 

近几年,随着基因测序技术的进步,基因测序的价格也在持续降低;另一方面,基因测序也逐步进入到了医疗健康行业。在医疗健康行业,人们会对基因测序存在一个误区,认为一生只要做一次基因测序就够了,但实际上从医疗健康检测角度来讲,基因测序是伴随我们一生都会用到的技术。

 

例如,在生命诞生之初,做试管婴儿时国内已有多家公司推出基因测序服务,对移植前胚胎进行遗传病筛查;再者,35岁以上的产妇做无创产前检测时,推荐的技术也是基于二代高通量基因测序的产前检测即对产妇外周血里游离DNA进行提取,通过测序和统计学手段判断胎儿是否存在非整倍体染色体疾病。

 

除了无创产前和遗传病检测,基因测序又一热门应用方向便是癌症早筛,通过检测血液中跟肿瘤相关的ctDNA,来诊断患者的癌症时期。除了检测ctDNA,还有一些通过检测甲基化表观遗传学位点来进行早期癌症预判的情形,背后也需要基因测序技术支持。

 

在癌症分型上,医学界也是通过基因突变类型进行划分的。基因突变需要通过基因测序确定,一定程度上也指导了精准医疗的靶向用药。

 

而在这次疫情的冲击下,基因测序的又一个临床应用——病原体研究和微生物组学也被印证了是一个蓬勃发展的市场。高通量基因测序技术大大提升了COVID-19的检出效率,从采样到最终得出结论,基本一天即可。

 

历代基因测序技术的升级与迭代

 

基因测序技术的发展基本上可以分为三个阶段,第一个阶段也就是我们常说的第一代测序——桑格测序法。这种测序的读长很长,可以达到1Kbp,准确率可达到99%,但是却存在低通量、不便携、成本高等缺点,一次人全基因组测序可能需要花费上千万美金。

 

随着基因测序技术的进步,二代基因测序技术便应运而生。经过近十年的发展,二代基因测序技术将基因测序的价格降至近1000美金。

 

二代基因测序是一种高通量、高准确率(99.5%)的测序技术,但它却也存在读长较短、读速较慢、单次运行成本过高、便携性较差等缺点。

 

二代基因测序是如何实现的呢?简单来讲它是一种大规模平行测序法,是将代测基因处理成短的DNA片段,通过簇生成或者单分子多拷贝聚集的方式“种”在检测芯片表面,然后通过生化循环完成一个个酶促反应实现循环列阵合成测序。之所以二代基因测序能够实现高通量,其背后原理便是在一个芯片上可以同时检测上上亿个基因片段。

 

现今二代基因测序技术的发展趋势如下:


自动化建库:sample to answer
更加密集/更强信号的的DNA簇阵列
更加快速和高效的低成本测序生化试剂
更高效的流体系统和高性价比的光学系统

 

而近几年又出现了一种新的基因测序技术,可称之为第三代基因测序技术,或者叫第四代基因测序技术。这是一种单分子连续测序的方式,检测的通量已经可以和第二代媲美,但在准确率上还有待提升。

 

这种技术本身是一种单分子测序的状态,所以存在很大的不确定性,但它具有其它方面的优势,比如读长很长,读速很快,单次运行成本低,设备小型化便携等。

 

单分子连续测序法不需要簇生成,测序流程相对简单,直接将单链DNA连续地通过传感器,便可产生出随时间变化的信号,这种模式可以想象成磁带播放的过程。

 

而在单分子的基因测序上,我这里简单介绍一下单分子实时荧光测序法以及纳米孔基因测序技术。

 

单分子实时荧光测序法主要指零维光导+gamma磷酸荧光技术。零维光导技术是在测序芯片表面覆盖一层带有几十纳米小孔阵列的铝膜,当激发光的半波长大于孔径时无法穿过Al层只能在孔的底部形成隐失波(evanescent wave),隐失波只激发在孔底部附近的荧光分子,因此荧光背景很低。。

 

Gamma磷酸上,A、T、C、G连接了不同颜色的荧光基团,单个(聚合酶+DNA模板+引物)固定在sensor附近,单个荧光核酸被DNA合成酶捕捉,给出荧光信号。延伸反应结束后,beta-gamma位的磷酸被酶切除,带着荧光分子离开,因此不会对下一个核苷酸的延伸造成影响。

 

纳米孔基因测序技术的原理是在由薄膜分隔的两个溶液腔里放置电极,膜上留一个洞,也就是我们的纳米孔。这时我们再外接电压,溶液中的离子在电场的驱动下穿过纳米孔,形成离子电流,电流大小与孔尺寸、形状,内部电荷,溶液离子种类、浓度,环境温度等相关,带电的生物分子在电场力驱动下穿过纳米孔,阻塞离子电流,形成阻塞电流信号,阻塞电流的大小与阻塞时间和生物分子的尺寸、极性、电荷、与孔的相互作用相关。

 

纳米孔基因测序技术又可细分为链测序法、外切酶测序法和标签测序法,这里就不做过多讲解。

 

 微信截图_20200313144402.png

高通量测序仪性能比较(截选自嘉宾演讲PPT)

 

关于未来,我相信第三代/第四代测序技术还有很长一段路要走,在提高通量、提高准确率上面还有很多技术有待挖掘。而再往后看,基因测序发展方向我预测如果不用中间态的生物性分子做信号转接或传递的话,直接采用固态纳米孔进行检测,那么更能实现基因测序的大规模量产,降低价格。目前,也不乏有研发人员在朝这个方向进行研究,不过都还停留在原理性验证阶段,相信未来的基因测序更值得期待。


注:文中如果涉及企业数据,均由受访者向分析师提供并确认。如果您有资源对接,联系报道项目,寻求合作等需求请填写需求表

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