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呼气检测:从辨味识病到代谢组分析的标准化之路

作者:动脉网的小伙伴们 2020-11-07 08:00

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本文作者:Patrick/奇迹之光  蓝色彩虹


呼气检测起源辨味识病


第一个用于确定人类生理状态的呼吸分析起源于希波克拉底时期(公元前460-370年),当时古希腊医生意识到可以从患者呼吸的特征气味中诊断出某些疾病,并且知道人的呼吸可能会提供有关健康状况的健全信息。在后来的医学实践中,医生能够很容易分辨出糖尿病患者、晚期肝病患者、肾衰竭患者和肺脓肿患者呼吸中的“水果味”(丙酮)、“霉味”、“鱼腥味”、“尿味”和“腐臭味”[1]。对呼出气中存在的VOCs的分析可以提供患者病理生理状况的宝贵信息,这些化合物是各种疾病和代谢活动的潜在诊断生物标志物。


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图一 呼出气成分示意图,来源:Owlstonemedical.com


高精度分析质谱仪的出现极大促进呼气检测科研发展


近代提出呼气代谢组学(breath metabolomics)的概念,当发生从健康状态到病理状态的转变时,人体呼气中的挥发性有机物( volatile organic compounds,VOCs)分布将被改变,并且可以被检测到并用于诊断和监测。从1970年代Pauling团队使用气相色谱仪(GC)检测人类呼吸中200多种VOCs之后,越来越多科研团队在研究呼气代谢组学。


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图二 1980~2015年间呼出气VOCs发表文章数统计,来源:breath biopsy complete guide


呼气中挥发性有机化合物的来源包括环境(称为外源性)、宿主(内源性)以及微生物组(居住于口腔、肺和肠道的微生物)。而宿主产生的VOCs是与临床疾病相关中研究最多的,用于诊断目的的呼气VOCs主要包括含:


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表一 呼气VOCs的化合物分类[2]


呼气检测已经在临床应用,更多检项仍待开发


在临床实践中已经建立了一些使用挥发性生物标志物的呼气检测。但由于寻找疾病生物标志物的研究之间缺乏可重复性,VOCs检测在临床应用中没有得到充分开发。


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表二 已经实际使用的呼气检测项目,来源:Johns Hopkins medicine、奇迹之光整理


肿瘤和感染性疾病筛查诊断是呼气检测未来的发展方向


在病理生理过程中,细胞代谢的改变会导致生化反应副产物VOCs的变化。包括缺氧、细胞过度增殖、过度的炎症和活性氧活性以及其他与癌症相关的病理机制都会导致局部和系统性VOCs的谱图和浓度发生明显变化。生物学家已提出了几种潜在的生化途径机制。例如,由于缺氧或炎性疾病,在癌症的微环境中的氧化应激有助于烷烃和甲基化烷烃的形成。癌症患者中细胞色素P450酶的过度活化可能会提高酒精水平。由局部缺氧引起的过度细胞增殖导致无氧呼吸,其中能量产生的糖酵解途径释放出酮和醇。


在众多研究中也发现在肺癌中呼气VOCs与体外细胞系中的VOCs部分重叠。表明除了癌细胞直接释放的VOC外,与疾病本身相关的继发性和/或全身性机制也会产生,这意味着VOCs作为标志物可以更全面的对人体生理病理状态做出判断[3]


现已知253种VOCs与不同肿瘤部位的癌症诊断有关,在大多数情况下,这些挥发性有机化合物主要是碳氢化合物(芳香族和脂肪族)和含氧化合物(即醛、醇、酚、羧酸、醚和呋喃),而含氮、硫和卤素的化合物较少。其中与癌症相关的最常见的是2-丁酮、1-丙醇、壬醛、异戊二烯、乙苯、4-甲基辛烷、3-羟基-2-丁酮、丙酮、甲苯、乙醇、戊醛、庚醛和戊烷等[4]


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表三 肿瘤患者呼出气VOCs的临床一期研究(不完全统计)[4]


多项研究表明,检测呼吸中的VOCs指纹图谱或化学基团可将患有微生物感染的个体与健康对照区分开[5]。由于细菌独有的新陈代谢产物是人类自身无法产生的,其中细菌特异性VOCs可以作为标志物进行诊断。比如脓毒症常见的六种菌(金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌)均产生异戊醇、甲醛、甲硫醇和三甲胺。而这六种菌株又各自产生特异性的金黄色葡萄球菌的异戊酸和2-甲基丁醛;用于铜绿假单胞菌的1-十一碳烯、2-丁酮以及大肠杆菌的甲醇、戊醇、乙酸乙酯和吲哚等[6]


对于病原感染来说现有很多检测方法,但是各有各的优缺点。常用的急性感染蛋白标志物有CRP、PCT和SAA等,这类检测的优点是快速便宜,但是无法精准辨别感染的菌种类别。而新晋的核酸检测包括PCR、mNGS等优点是可以对感染菌种准确分型,且可以分析耐药信息以获得更好的用药指导及预后。但是检测周期较长,对不同感染类别的取样及样本类型要求复杂多变以及价格较高是限制临床全覆盖的重要因素。因此一个检测方便快捷、价格便宜且可以对菌种分型鉴定的呼气检测有其独特的临床优势。


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表四 部分感染性疾病及其潜在VOCs,来源:奇迹之光-文章整理


样本采集的标准化可以提高检测结果的重现性


宿主和共生微生物的内源性VOCs相互作用大大增加了呼气代谢组的复杂性,而且呼气中VOCs含量通常非常稀少,低至百万分之几(ppmv)甚至十亿分之几(ppbv),因此要实现可靠、高质量、标准化的呼吸采样及分析检测存在相当的挑战。


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图三 呼气采集流程[7]


样品预浓缩方法与高灵敏度的分析仪器至关重要,样本采集核心是采集到不包含环境气体成分的内源性气体,以供精确分析和避免干扰因素。


一次连续的呼气根据CO2分压分为四个时项相,分别是死腔通气、死腔通气及肺泡内气体体混合过渡期、肺泡气和呼气末期。相比于阶段Ⅱ和阶段Ⅲ的混合采样来说,阶段Ⅲ的采样更具有代表性,且避免了引入外源性气体带来的检测结果假阳性。采样的原则是在获取呼吸样本时需要严格控制流程并保证采样可重现。


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图四 时间-二氧化碳分压波形图[7]


样本预浓缩有助于提高检测性能,但带来样本损耗及重现性差


由于传统的分析方法限制,需要对样本进行预浓缩以提高分析精度,同时也一定程度降低分离纯化过程中会带来的巨大损耗。常见的气体样本浓缩方法有热脱附(TD)管和固相微萃取(SPME)。


热脱附管用吸附剂把气体吸附富集,再通过加热的方式解吸附释放到检测仪器中。常用的吸附剂包括Tenax TA & GR、Carbograph 5TD、碳分子筛(Carboxen)等。为了防止分析物的过度吸附损失导致失去一些痕量的潜在VOCs标志物,对挑选吸附材料也极为讲究。但无论是在挥发性还是在极性方面,填充界面的分析物与吸附剂之间的相互作用会一定程度的影响重现性,从而影响化合物的回收率,甚至可能影响储存期间的稳定性。


固相微萃取是一种非常简单有效的无溶剂样品制备方法,可以把常规液-液萃取的所有步骤包括萃取、浓缩和转移检测都集成到一个设备中,从而大大简化了样品制备过程。它将涂覆的熔融石英纤维暴露于样品的顶部空间,然后使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚丙烯酸酯(PA)涂层材料作为吸附,样品中的分析物被直接富集到纤维涂层中,最终与气相色谱法联用进行VOCs的检测[8]


但无论是吸附柱也好,固相微萃取也好,都无可避免因为富集带来的富集材料选择、耗材成本高和吸附损耗问题。这会极大影响样本检测的重现性,从而影响结果的准确性。无需富集的高灵敏在线分析仪器则很好解决了这些难题,也是推向临床应用的一大重要因素。


可靠、标准化和高质量的在线分析是临床发展方向


目前科研最常用的是高灵敏GC–MS分析系统,结合预浓缩系统可以有效地离线收集、分离和鉴定人呼吸中大多数化合物,如脂族化合物、醇、醛、酮、胺及卤代化合物,也足够敏感去量化ppbv水平的VOCs。但GC-MS的耗时、昂贵、富集损耗、操作困难、无法实时检测和重复标准化测量是临床应用的巨大阻力。


E-nose电子鼻利用纳米传感器阵列检测呼出VOCs的复杂混合物的已知成分,具有小型化便携、实时分析成本便宜的优势,但对于复杂疾病的研究和低浓度VOCs的精准定量分析却无能为力。


相比于GC-MS,质子转移反应质谱(PTR-MS)检测VOC浓度可达pptv水平,可在线多次检测且不需要费时昂贵的预浓缩步骤,目前已用于监测麻醉、呼吸曲线和血液透析。但是对于VOCs分析而言也存在难检测低碳烷烃类物质及细菌代谢相关硫化物的局限。


大连化物所新开发的SPI-TOF利用复合电离技术能够快速在线分析气体中的痕量成分,其重复性好、碎片化程度低且无需预富集,具有成为VOCs标准分析工具的潜力。


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表五 现有VOC检测技术及性能对比,来源:奇迹之光整理


商业化尚未成熟,机会众多


不完全统计国际上呼气相关的公司有9家,分布在各个国家,其中Owlstone是最有代表性的融资最多的企业,但离领军地位还有一段距离。


商业化的检测技术主要有质谱(GC-MS、SIFT-MS、FAIMS、SESI-MS)和传感器。大多数公司成立于2015年后,仍在做技术优化和临床验证,整个行业处于早期发展阶段,竞争并不激烈。产品管线多集中在肺部疾病、肿瘤、血糖和消化系统疾病。美国国家癌症研究所提供200万美元赠款资助Menssana Research多中心盲法研究,多家企业也连续拿到了融资,行业发展趋势良好。


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表六 商业化公司不完全统计,来源:奇迹之光整理


呼气检测行业的转折点已经到来,产业爆发指日可待


从古代辨味识病到现在代谢组分析,一直朝着呼气检测的方向进行突破。但是由于代谢组学的复杂性,呼气检测流程中样本采集、样本浓缩及分析流程没有标准工具和流程优化,导致产业化困难重重。所有的基础研究都在探索不同的气体采集方式,采用不用策略的样本浓缩,并且需要处理吸附-解吸附的损耗和分离偏差的问题,最终学术上对于同一病种的VOCs标志物组合没有一个明确的定论。


随着在线分析技术进一步迭代升级,将无需样本浓缩带来的系统误差。同时,高灵敏度分析仪器可以标准化高通量分析样本。在疾病的筛查诊断上的标志物会逐步形成共识,低成本操作简便的非侵入式呼气检测正处于产业爆发的前夕。



【参考文献】

[1]Francesco FD, Fuoco R etc.Breath analysis: Trends in techniques and clinical applications. Microchemical Journal. 2005;79:405–410.

[2]Souvik Das, Saurabh Pal, Madhuchhanda Mitra.Significance of Exhaled Breath Test in Clinical Diagnosis: A Special Focus on the Detection of Diabetes Mellitus. J Med Biol Eng. 2016; 36(5): 605–624.

[3]Hakim M, Broza YY, Barash O, et al. Volatile organic compounds of lung cancer and possible biochemical pathways. Chem Rev 2012; 112: 5949–5966.

[4]Hanna GB, Boshier PR, Markar SR, Romano A. Accuracy and Methodologic Challenges of Volatile Organic Compound–Based Exhaled Breath Tests for Cancer Diagnosis: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA Oncol. 2019;5(1):e182815. doi:10.1001/jamaoncol.2018.2815.

[5]Waqar M. Ahmed,Orcid etc.Exhaled Volatile Organic Compounds of Infection: A Systematic Review.ACS Infect. Dis. 2017, 3, 10, 695–710.

[6]Lieuwe D.J.Bos,PeterJ.Sterk.Volatile Metabolites of Pathogens: A Systematic Review.plospathogens. May 9, 2013.

[7] Exhaled breath analysis: a review of ‘breath-taking’ methods for off-line analysis;Oluwasola Lawal, Waqar M. Ahmed etc.Metabolomics. 2017; 13(10): 110. Published online.

[8]Solid-phase microextraction: a powerful sample preparation tool prior to mass spectrometric analysis.Vas G, Vékey K. Mass Spectrom. 2004 Mar; 39(3):233-54.


关于蓝色彩虹

蓝色彩虹是由华大发起,服务于全球生命科学与精准医疗初创公司的孵化与创投平台,关注在DNA、RNA、蛋白、细胞、组织等多组学尺度上的前沿研究与技术,致力营造全要素支持的创新生态,提升产业转化效能。

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